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猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

来源:http://www.dcmarijuanalaw.com 作者:澳门新萄京赌场网址 时间:2019-10-22 19:08

猪传染性胃肠炎引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。tge首次由doyle和hut... 图片 1
猪传染性胃肠炎引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。tge首次由doyle和hutchingsl946年在美国报道,日本先后报道该病,这之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道发生了tge,现已成为一种世界性猪的疾病。我国从60年代起就有tge的报道,近些年来有进一步流行的趋势,尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行,给养猪业造成极大危害。在1984年和1986年间,欧洲北美等地又报道了一种特别的tgev自然缺失变异株-猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus,prcv),我国目前仍未见有该病毒的报道。tgev仍是现今引起仔猪发病和死亡的主要原因之一。1992年美国猪场tge血清阳性率为36%,大多欧洲国家猪场阳性率几乎为100%,我国台湾地区1993年仔猪tge的阳性率高达65%。本文就tgev研究进展作一综述。
1 形态学特征
tgev属于冠状病毒属,是一种多形性有囊膜的病毒。病毒粒子呈圆形或椭圆形,直径约为90-160 nm,外膜上覆有花瓣状纤突,纤突长而稀疏,末端呈球状,直径10nm左右。某些病毒粒子在以磷钨酸负染后,可见到一个电子透明中心或没有特征的核心,其内部具有一个呈串珠样的丝状物。
2 理化学特性
tgev在冻存状态下很稳定,肠组织内病毒在-20℃ 下保存6~18个月滴度无明显下降,但病毒不耐热,加热65℃ 10 min或56c45 min即全部灭活。粪尿中病毒粒子在5℃下存放8周、20℃下2周和35 ℃下24h仍具有感染性。病毒在光、紫外线照射下迅速灭活,对乙醚、氯仿和去氧胆酸钠敏感,而在胆汁中相当稳定。用0.05%甲醛溶液37℃处理20 min即能使病毒灭活。tgev在ph4~8时稳定,对胰酶有抵抗力,能耐0.5%胰蛋白酶1 h,但强、弱毒株对胰酶和蛋白分解酶的敏感性不同,毒株的毒力越弱,其对胰酶的敏感性越高。tgev的这些特性有利于自身抵抗胃肠的酸碱环境。至今仍未阐明各种化学、物理的处理对tgev敏感性、毒力影响的直接关系。
3 生物学特性
tgev和prcv野毒株对细胞培养的适应情况不一,较敏感的细胞是猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、猪睾丸细胞和胎猪肾细胞,此外也可用食管、小肠组织块等分离病毒。近年来,st、pkl5细胞系成为实验室培养tegv和prcv易感并方便的细胞培养基。tgev感染细胞后4~5 h,就可在细胞中用免疫荧光试验检测到病毒抗原,病毒通过内质网的出芽形式成熟,成熟病毒从感染细胞逸出被覆在宿主细胞膜表面。tgev主要侵染小肠绒毛上皮细胞并增殖,引起绒毛显着萎缩,导致病猪发生严重腹泻。prcv主要侵染呼吸道上皮细胞和肺组织,在小肠上皮细胞中只能零星局部感染,不引起腹泻,不产生或仅产生轻微的呼吸道症状,但感染了prcv的猪如继发感染了细菌或其他病毒则会引起呼吸道疾病,甚至引起病猪突然死亡。
4 基因组成、结构与功能
tgev与prcv含有一大的聚腺苷酸化的单链正股rna基因组,病毒基因组的复制和表达与其他冠状病毒相似。tgev的基因组全长约28~30kb左右,分子量为9x106kda,在其5‘端有一帽结构。3’端有一共价结合的polya结构。tgev的5‘端约20 kb的序列编码rna依赖的rna聚合酶,在3’端约8.4 kb序列含8个开放读码框架,编码亚墓因组rna表达的全部mrna基因组。所有mrna都具有相同的3'polya末端,5‘末端则长短不一。除了mrna8之外,所有mrna都是多顺反子结构,但只有在5’末端的单一序列才具有编码功能。
4.1 pol 酶
冠状病毒的5‘端不翻译区域被认为是编码rna依赖的rna聚合酶。在tgevpurdue-115株的5’端约20 kb的序列中含有2个大的开放读码框架orfla和orflb,分别含有4 017和2 698个密码子。在orfla的上游有一个长3个密码子的小orf,冠状病毒属的传染性支气管炎病毒和人冠状病毒hcv229e的同源小orf则分别长8个和11个密码子。在tgev的orfla和orflb各自翻译产物中均含有一个核糖体移码激活区。tgevorfla的氨基端较羧基端表现出更大的序列差异性,tgevorflb较保守。
4.2 mrna基因组
tgev进入感染细胞后,由先导rna引物起始转录合成,正链rna先转录出一条负链rna。先导rna序列从负链模板上独立转录下来,然后与负链模板上各基因起始处的同源亚基因序列配对,引导mrna的合成。mrna的合成是不连续的,尚未合成完毕的mrna可从模板上脱落下来形成游离的mrna中间体,这些中间体又可重新接合到模板上继续合成。tgev整个先导序列长约90个核苷酸。在大多mrnaorf的上游存在先导rna引物识别序列actaaac,但mrna4的识别序列为ctaaac,缺少一个a,这被认为是导致mrna4较小的原因。
4.2.1 s基因
tgev s基因编码的s蛋白全长为1 447-1 449个氨基酸左右,内含有32~34个n-联糖基化位点。s蛋白的n-联糖基化位点的变异主要集中在氨基端区域。s蛋白的4个主要抗原位点也存在于氨基端区域。a位点主要诱导中和抗体的产生,可分成aa、ab、ac 3部分,核心分别存在于538、591和543等3个残基处,a位点在s蛋白中保守存在。其他3个位点,b存在于97-144残基区,c位点存在于49-52残基区,d位点存在于382-385残基区,b、c、d三位点均不保守。a、b两位点是依赖于s蛋白的糖基化作用和正确折叠构型产生的,而c、d两位点的这种依赖性则很小。比较prcv的基因组发现,在等位于tgev的s基因起始密码子下游59核苷酸处,存在672个核苷酸的缺失,编码21-245氨基酸残基缺失,不存在‘b、c、d 3个抗原位点。prcv在s基因处的缺失机制仍不清楚,但聚合酶作用下的rna重组可能是原因之一,有人推测tgev疫苗免疫的压力也起了重要作用。
4.2.2 mrna3 tgev的mrna3含2个orf:orf3a和orf3b,分别编码2个非结构蛋白。内含有n-联糖基化位点。orf3a区的点突变、缺失和插入造成了tgev不同毒株在此区的变异较大,orf3b较保守。mrna3区域与tgev的病原性或毒力强弱密切相关。比较tgev和prcv的mrna3,发现等位于tgev orf3a的起始密码子处,prcv缺失了22个碱基,在orf3a的225碱基处,prcv缺失了13个碱基,没有acta序列,从而先导rna引物识别序列actaaac缺失,导致prcv在orf3a区缺失。在等位于tgev orf3b处,tgev的3个t被prcv的2个a和一个c替换,prcv在此形成了一个新的先导rna引物认识序列aactaaac,从而使得prcv在mrna3亚基因处出现一个orf。tgev还有一种小蚀斑表型改变变异株,其s基因与野毒型tgev s基因相似,但sp病毒s基因下游却出现一大的缺失,这一缺失导致一潜在病毒编码蛋白的orf丧失,并使第二个潜在病毒蛋白的n端部分丧失。这两个orfs在高代次细胞传代的nouzilly株也不存在。因此有人认为sp病毒、nouzilly株和prcv株的病原性或毒力改变与这些基因缺失和替换有关。
4.2.3 orf4、m、n、orf7 tgev的这些区域高度保守,未发现prcv同tgev有很大差异,同源性高达98%。orf4编码82个氨基酸长的膜相关蛋白,此区域不是病毒增殖的必需区,它的表达可能与病毒粒子的病原性或毒力有关。orf7编码78个氨基酸。
5 主要结构蛋白及功能
5.1 s蛋白 该蛋白位于病毒的最外面,构成病毒的纤突,分子量200 kda左右。s蛋白氨基端是tgev识别靶细胞、诱导产生中和抗体和决定病毒组织嗜性的密切相关区。其中219残基区与病毒粒子对肠道的组织嗜性至关重要。不同毒株氨基端变异较大。s蛋白羧基端构成纤突的柄及跨膜区,高度保守。在tgevs蛋白的n端区域存在一血凝活性区,用唾液酸酶处理tgev可激发血凝活性,但此区域在prcv s蛋白中缺失,因此检测血凝活性的存在与否是一种区分prcv和tgev的方法。
5.2 m蛋白 m蛋白长约262个氨基酸,分子量28-31kda。m蛋白的羧基端暴露在病毒粒子的表面,是病毒的免疫显性区,针对此区域的抗体可以中和tgev和介导tgev感染的细胞发生补体溶解反应。m蛋白氨基端6-22残基区存在一干扰素基因决定簇,可在体内外诱导。-干扰素的产生。
5.3 n蛋白 是病毒粒子内部的一种蛋白,由382个氨基酸组成,分子量47kda,主要构成病毒的核蛋白。n蛋白具有3个抗原区域,这3个抗原区域在tgev分离株中均高度保守,但prcv在b区域与tgev有差异。n蛋白含有蛋白水解位点,通过蛋白水解作用和去磷酸化作用,对病毒粒子的装配起重要影响。
6 与相关冠状病毒抗原性、基因组之间关系 通过血清学方法可将冠状病毒分为3个抗原组,其中tgev与prcv、犬冠状病毒、猫肠道冠状病毒、人冠状病毒的抗原性之间存在相关性。tgev和相关冠状病毒均含有3种基因相似结构蛋白:s蛋白、n蛋白和m蛋白。此外,tegv坯含有另一种结构蛋白sm,而其他一些冠状病毒则含有另一种结构蛋白he,gp65通过二硫键形成二聚体,这种二聚体在s蛋白纤突下形成第2个冠,gp65具有血凝活性。冠状病毒s蛋白是否可裂解成两部分是冠状病毒分类的另一特征。tgev和相关冠状病毒的s蛋白不能分裂,而火鸡冠状病毒、hcv、oc43、bcv、mhv、ibv及hev等在纤突蛋白上存在一蛋白分裂位点,可使s蛋白分裂为s1和s2两种蛋白。而根据核酸序列数据可将tgev、prcv、ccv、fipv、fecv、pedv和hcv229e分为一组。
7 免疫原性 s蛋白是tgev的主要抗原蛋白,其受体是b细胞,可介导引起体液免疫应答。tgev还是一种细胞依赖性的病毒抗原,t细胞可对整个病毒粒子产生应答反应,引起细胞免疫应答。prcv与tgev的病原性,组织嗜性不同,但抗原关系密切。用prcv制成的活苗免疫孕母猪可引起较高水平的igg,但iga和igm的水平不高。有人认为这是因为prcv主要在呼吸道组织中增殖,而呼吸道的淋巴小结较肠道内淋巴小结少很多,故抗原刺激呼吸道产生的淋巴母细胞少,从而使得局部产生的iga少。看来,prcv可提供抗tgev的部分保护力。
8 病原性
8.1 组织嗜性和宿主细胞 tgev主要是一种肠道病原体,但也可以在呼吸道中增殖。对tgev分离株进行连续细胞传代可使病毒丧失对肠道的组织嗜性,但仍对呼吸道组织和肺泡巨噬细胞保持嗜性。高度致弱的tgev可在上呼吸道中增殖,包括扁桃体和肺,但不能在新生仔猪肠道中增殖。尽管tgev通常引起急性肠道疾病,但也可持续感染,此时从肠道中一般检测不到病毒,相反能从感染后100天的康复猪的呼吸道中检测到病毒。
8.2 病毒受体 tgev的受体是细胞表面的氨肽酶n和200 kda的蛋白分子。小肠上皮细胞、成纤维细胞刷状缘和肺等均可表达丰富的papn,小肠分泌的papn对多肽的消化起重要作用。3日龄以内的仔猪绒毛上覆盖着上皮细胞分泌的papn,而另一受体200 kda的蛋白分子在微绒毛的顶端大量存在,在绒毛上皮细胞中则含量很少,这被认为是tgev对新生仔猪敏感的原因之一。初乳、乳汁内的因子可以影响200kda的蛋白分子或papn的表达,同时可干扰病毒与受体的结合,这是喂初乳的仔猪比不喂初乳的仔猪更易耐受tgev的感染,感染率和死亡率下降的原因。
8.3 年龄因素 tgev病原性与感染猪的年龄关系密切相关,病毒感染成年猪的剂量比感染新生仔猪剂量要高10倍。
8.4 传播宿主 育肥猪和哺乳母猪是tgev的重要传染源,可通过污染了的粪便、哺乳母猪的乳汁、饲料以及工作人员的鞋子、衣物等传染给仔猪。此外,猫、狗、狐、苍蝇、鸟也可能是tgev的传染源。
8.5 腹泻的发生机制 经口或鼻感染的病毒,经吞咽到达猪的小肠后,在肠绒毛上皮细胞上增殖,从而造成黏膜物理性屏障和酶活性降低,出现电解质失衡和营养成分的分解吸收异常,导致肠管内的渗透压增高,进而出现脱水和腹泻;特别是损害小肠黏膜上皮,导致产生乳糖酶等酶类的机能受阻,妨碍了糖类的分解吸收;另外由于小肠绒毛萎缩,使肠隐窝细胞代偿性增生,分泌作用增强,以及肠管内的异常发酵等,这些都是造成腹泻和病情恶化的原因。

摘 要:猪繁殖与呼吸综合征病毒 是严重危害养猪" target="_blank" href="http://cj.zhue.com.cn/jinrijujiao/">养猪业的病原,论文概述了PRRSV的生物学特性和基因组的结构及编码的结构蛋白,综述了PRRSV新型疫苗、反向遗传技术和分子诊断的研究进展,为PRRS的预防和诊断提供科学依据。

关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;新型疫苗;反向遗传技术;分子诊断

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状和高病死率为特征的传染病。自1987年首次在美国发现以来,相继在各国呈流行性感染,给世界养猪业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。1991年Wensvoort等首次分离到该病毒,在第10次国际病毒大会上将该病毒归属于新设立的动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。根据PRRSV基因组成和结构蛋白抗原特性的明显差异,又将PRRSV分为以LV株为代表的欧洲型和以ATCC VR­2332株为代表的美洲型。两个毒株间氨基酸的同源性为78%~81%。1996年,郭宝清等首次报道从流产胎儿中分离到PRRSV,证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。2006年以来,我国又暴发了以变异美洲型的高致病性蓝耳病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1­2]。近年来,越南、老过、缅甸等周边国家也相继暴发PRRS。

1 PRRSV的生物学特性

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒,病毒粒子直径45 nm~65 nm,核衣壳25 nm~35 nm,表面有明显的长约5 nm的纤突,核衣壳呈立体对称的20面体。PRRSV对温度和湿度较敏感,潮湿环境有利于PRRSV的存活,在低温下可长期存活,但在干燥条件下病毒的感染性迅速失活。PRRSV对pH变化敏感,在pH 6.5~7.5间相对稳定,超出这个范围其感染力可下降90%以上。PRRSV不具有凝集红细胞特性,但经非离子除垢剂和脂溶剂处理后可凝集小鼠红细胞。病毒在蔗糖和氯化铯中的浮密度分别为1.13 g/cm3~1.19 g/cm3和1.18 g/cm3~1.23 g/cm3 。在猪体内,病毒对单核巨噬细胞系统有嗜性,尤其是猪肺泡巨噬细胞;在体外,病毒可在Marc­145、MA­104和CL2621等多种传代细胞系上繁殖,产生的细胞病变一般不明显,但高致病性蓝耳病毒株在Marc­145细胞中适应1代~3代即可产生明显的细胞病变。PRRSV具有抗体依赖性增强作用(antibody dependent enhancement,ADE),当病毒和抗体结合产生抗原抗体复合物后,借助Ab的Fc片段与靶细胞的Fc受体结合,从而促进病毒进入细胞。因此在细胞培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体,可显著提高病毒的含量。PRRSV可通过胎盘感染胎儿,造成流产和木乃伊胎。另外,PRRSV在猪体内可造成持续感染。

2 病毒基因组结构及编码蛋白

2.1 病毒的基因结构

PRRSV 为不分节段的单股正链RNA 病毒。基因组长约15 kb,基本结构为5′­帽子结构­非编码区­ORF1a­ORF1b­ORF­非编码区­poly­3′。其中帽子结构有助于维持病毒基因组的稳定,防止被核酸酶降解。5′端非编码区(non­coding region,NCR)长约190 nt,高度保守,在两种血清型毒株中其同源性可达99%。病毒基因组相邻的编码框有部分重叠。ORF1 包括ORF1a 和ORF1b,长约12 kb,占基因组的80%,编码病毒依赖RNA 的RNA 聚合酶。编码框ORF2~ORF7 编码病毒结构蛋白,其中, ORF2~ORF6 编码与病毒膜有关的蛋白,ORF7编码病毒核衣壳蛋白。ORF7 终止密码子之后为3′非编码区,含有一个poly 尾。Conzelmann 等报道,LV 株3′非编码区为114 nt。Mardassi 等报道,3′非编码区为151 nt,其中欧洲株 3′端非编码区比美洲株少37 nt,二者同源性为59%,利用这种差异可进行PRRSV 的分子诊断和病毒分型。值得指出的是,在高致病性蓝耳病的病毒基因组中,非结构蛋白Nsp2基因的第1 447~1 449位和第1 597~1 698位的核苷酸发生了缺失,与我国2005年以前分离的PRRSV相比,Nsp2基因的同源性仅为69.8%~86.2%[3]。

2.2 结构蛋白

GP2由ORF2编码,分子质量约为30 ku。GP2为糖蛋白,有两个明显的疏水峰和糖基化位点,肽链内含有二硫键,通过二硫键和其他结构蛋白可形成同源或异源多聚体,其糖基化位点覆盖有N­聚糖复合物。GP2蛋白表面有一个抗原位点,其周围有一个与GP5蛋白B细胞抗原位点构成一级结构的VSRRIYQ基元。GP2蛋白免疫原性差,在病毒中含量较少,很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒子中进行分离鉴定[4]。

GP3由ORF3编码,其分子质量约为45 ku,含有265个氨基酸,有7个N­糖基化位点,但是否为病毒的结构蛋白还有争议。GP3是PRRSV各毒株间保守性较差的蛋白之一,美洲型与欧洲型ORF3编码的氨基酸同源性低于55%,其功能可能与诱导细胞免疫有关。

ORF4编码GP4,其分子质量大约为19 ku~20 ku,能诱导产生中和抗体。是组成病毒粒子的次要囊膜蛋白,通过共价键与GP3和GP2形成异源三聚体,并以异源多聚体的形式组装进PRRSV颗粒,它们对形成感染性病毒颗粒是必要的,不表达GP2, GP3或GP4蛋白的基因敲除载体仍然能够组装成病毒粒子,但不具感染性[5]。

ORF5编码的糖基化囊膜蛋白GP5,又称E蛋白,含有4 个糖基化位点。分子质量为22.4 ku,有6个抗原决定簇,是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白,病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性;GP5还可诱导细胞凋亡。GP5是PRRSV结构蛋白中变异最大的蛋白,同型毒株GP5氨基酸的同源性在88%~99%之间。而欧、美型毒株GP5氨基酸的同源性仅在52%~55%之间。loemba H D等研究表明,E蛋白抗体比其他蛋白抗体产生得早,接种后7 d即可检测到。

ORF6编码膜基质蛋白又称M蛋白,分子质量为19 ku。M蛋白能刺激T淋巴细胞的增生,诱导产生的抗体具有中和作用。M蛋白是PRRSV中最保守的蛋白,欧、美型毒株间M蛋白氨基酸序列同源性在78%~81%,而同型毒株M蛋白氨基酸的同源性大于96%。M蛋白可能在维持病毒形态、病毒组装和出芽中发挥作用。

ORF7编码核衣壳蛋白又称N蛋白,分子质量约为15 ku。N蛋白至少有5个抗原决定簇,其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇,具有一个糖基化位点,但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys和His 3种碱性氨基酸组成,这是两种血清型毒株所共有的特点,它们可能和RNA基因组间的相互作用有关。蛋白之间以二硫键形成同源二聚体。N蛋白的保守性较好,在病毒粒子中含量可达20%~40%,免疫原性强。感染PRRSV后约10 d可产生该蛋白抗体,产生的抗体无中和活性。通过对其抗体的检测可进行诊断,基于重组N蛋白的ELISA已应用到PRRS诊断与流行病学调查中[6]。

3 PRRSV的新型疫苗研究

近年正在研制的PRRS的新型疫苗主要有基因疫苗和活载体疫苗。由于GP5含有病毒的中和位点,因此大多数PRRS新型疫苗都是以GP5为靶抗原研制的。

3.1 基因疫苗

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